Assassins Creed: Brotherhood gaat verder waar Assassinss Creed II gestopt is. Opnieuw draait het verhaal om de Ezio Auditore di Firenza. Zijn taak is om in het oude Rome de zeer invloedrijke en tevens corrupte Templar Order tot stoppen te brengen. Dit gevecht tegen de Tempeliers hoeft hij niet alleen aan te gaan, want Ezio krijgt hulp vvan zijn eigen Brotherhood. Deze Brotherhood bestaat uit een groep van oude collega’s die als huurmoordenaars hebben gewerkt. Ook wordt hij dit keer weer hulp van een hoop legendarische beroemdheden als Leonardo da Vinca, Caterina Sforza en Niccolo Machiavelli.

Het nieuwe van Assassins Creed: Brotherhood is dat er naast een singleplayer modus ook een multiplayer modus bij zit. Hierdoor is het nu mogelijk om online tegen andere gamers te strijden. Je kunt uit verschillende personages een keuze maken. Ieder personage heeft zijn eigen wapens en technieken die ervoor zorgen dat iedere personage uniek is.